질병 모델링 및 신약 개발에서의 만능 줄기 세포의 이용

한국과학기술원 / 최민석

[목 차]

1. 서론

2. 인간 만능 줄기 세포(PSC)에서 질병 모델 생성

  2.1 질병 관련 인간 만능 줄기 세포 라인을 생성하는 전략
  2.2 질병 모델링에 대한 리프로그래밍의 영향

3. 인간 만능 줄기 세포를 이용한 질병 모델링

  3.1 단일 및 복합 질환의 모델링
  3.2 초기 그리고 후기에 발병하는 장애 모델링
  3.3 후성 질환 모델링

4. 고급 배양 기술을 이용한 모델링

5. ES 세포와 iPSC의 모델 비교

6. PSC를 이용한 약물 치료

  6.1 PSC를 이용한 약물 스크리닝 전략
  6.2 신경 장애와 관련된 약물 발견

7. 전망

[요약문]

인간의 질병 모델링은 그와 관련된 세포 및 분자적 메커니즘의 실험적 정의와 치료법 개발을 가능하게 했습니다. 자가 재생(self-renewal)이 가능하고 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 인간 만능 줄기 세포(human pluripotent stem cell, hPSC)의 유용성은 이제 특정 질환에 대한 동물 모델의 한계를 극복하는데 도움이 되고 있습니다. 우리가 hPSC를 이용하여 인간의 질병을 모델링하는 것은 단일(monogenic), 복합(complex) 및 후성(epigenetic) 장애(disorder)뿐만 아니라 조기 및 후기 발병 질환을 연구하는 방식을 혁신적으로 변화시켜 놓았습니다. 배아 줄기 세포(embryonic stem cell, ES cell) 또는 환자-특이적으로 유도된 PSC (induced pluripotent stem cells, iPSCs)를 사용하여 질병 모델을 형성하고, 그 모델 확립을 통하여 약물 스크리닝에서 이들의 사용에 대한 새로운 가능성을 창출하는 몇 가지 전략을 본 리뷰를 통해 소개하고자 합니다.

1. 서론

인간 병리 현상을 근간으로 하는 생물학적 과정에 대한 포괄적인 시각은 예방과 치료 전략을 고안하는데 결정적인 역할을 합니다. 많은 질병에서 분자 기반으로써 유전자 자위(genetic loci)로 좁혀 질 수 있기 때문에 이러한 질병을 모델링하는 것은 적절한 실험 환경에서 특정 유전자형을 연구를 가속화 할 수 있습니다. 포유류 유전체가 진화적으로 보전되면서 마우스 및 비인간 영장류와 같은 동물 모델은 생체 내에서 다양한 발달 단계 및 다양한 세포 유형에서 질병 기전의 해석을 가능하게 하였습니다. 이는 다시 인간 장애를 모델링하는 매우 중요한 도구로 부상하게 되었습니다. 형질 도입 및 유전자 표적화의 출현은 마우스를 특히 유용하게 만들어 생물 의학에서 가장 많이 사용되는 모델 생물 중 하나가 되게 했습니다. 그러나 약 1억 년 전 고대 조상들의 발생 이후 인간과 마우스는 상당한 부분에서 발달, 유전적 그리고 생리학적 차이를 보이게 되었습니다. 예를 들어, 두 종은 배아 발생의 여러 측면, 특히 원추 형성(gastrulation) 과 기관 형성 과정(organogenesis)에서 다르게 나타납니다. 그리고 생리학적 수준에서 인간과 마우스는 많은 장기기관의 기능이 다르다는 것이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 심장 크기와 휴식 심장 박동수는 크게 다르다는 것입니다. 극단적인 경우, 동일한 유전자형이 한 종에서 치명적일 수 있고 다른 종에서는 생존할 수 있게 됩니다. 예를 들어, 단핵구 X가 있는 마우스가 생존할 수 있는 반면, 이 비정배수(aneuploidy)는 일반적으로 인간의 태아에게 치명적입니다. 반대로, 인간의 BLM 유전자의 돌연변이가 지놈 불안정성과 암을 특징으로 하는 블룸 증후군(Bloom syndrome)을 일으키지만, 마우스 상동 유전자의 돌연변이는 치명적입니다. 이러한 이유로 인간에서의 생의학(biomedical) 연구를 수행하는 것이 바람직하지만, 이는 거의 항상 시험 관내(in vitro) 시스템으로 제한되는 것이 그 때문입니다. 환자 유래 세포를 배양하는 것은 분자 및 세포 수준에서 질병 원인을 연구하고 치료법을 개발하는데 대단히 유용하게 사용됩니다. 그 예로, 암 연구는 종종 환자로부터 쉽게 격리될 수 있는 종양 세포에 의존하게 됩니다. 마찬가지로, 유전 질환의 모델링은 혈액 또는 조직 생검(biopsies)에서 환자 유래 불멸화 세포주를 이용함으로써 촉진될 수 있습니다. 그러나, 질병의 표현형은 분리하기가 더 어렵고 배양 단계에서 지속적으로 성장할 수 없는 세포 유형에 종종 특이한 세포 형으로 존재하기도 합니다. 인간의 만능 줄기 세포(PSC)는 정상적인 1차 세포주이며, 무기한 자가 재생(self-renewal)을 위한 내재적인 능력이 있으며, 분화를 통해 거의 모든 세포의 운명을 결정할 수 있는 3가지 중요한 이점을 지니고 있습니다. 이러한 특성은 광범위한 인간 세포 유형 및 분화 상태에서 유전자형(genotype)–표현형(phenotype) 관계를 연구할 뿐만 아니라 약물 스크리닝 및 세포 치료를 포함한 다양한 목적으로 많은 세포를 확보 할 수 있게 합니다.

본 리뷰논문에서는 인간 만능 줄기 세포(PSC)가 질병 모델링 및 약물 개발을 위한 플랫폼으로 생성되고 활용되는 방법을 설명하고 있습니다. 우리는 여러 종류의 질병 연구를 위한 모델로서의 이 세포의 적합성을 논의하게 되는데, 예를 들어, 단일 유전 질환 및 복합 질환, 조기 발병 및 후기 발병 질환 그리고 우리는 질병 모델링에서 인간 배아 줄기 세포(ES cell)와 유도 만능 줄기 세포(iPSCs) 사용의 장단점에 대해서도 논의하게 됩니다. 또한, 우리는 PSC 기반 모델을 약물 스크리닝에 사용하는 다양한 전략을 설명하고 환자 유도 iPSC를 사용하여 신경 질환에 대한 약물 발견의 현재 동향을 강조할 것입니다.

2. 인간 만능 줄기 세포(PSC)에서 질병 모델 생성

질병 모델링을 위한 인간 만능 줄기 세포 관련 모든 연구는 분자 결함을 지닌 세포주를 확립함으로써 시작되게 됩니다. 이러한 세포들은 미분화(undifferentiated) 또는 분화된 상태에서 견고한 질병 표현형을 확인하는데 사용되며, 약물 검사와 같은 질병 메카니즘을 밝히고 새로운 치료법을 고안하기 위해 다양한 방법들을 사용할 수 있습니다. 지금부터는 질병 특이적 만능 줄기 세포주 라인을 생성하는 일과 세포의 리프로그래밍(reprogramming)이 우리에게 주는 엄청난 기여에 대해 설명하고자 합니다.

• 질병 관련 인간 만능 줄기 세포 라인을 생성하는 전략

인간 유전 질환에 대한 모델링은 여러 유형의 인간 만능 줄기 세포를 다양한 방법을 사용하여 생성할 수 있습니다(그림 1). Lesch-Nyhan 증후군을 일으키는 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) gene을 표적으로 삼고 질병 표현형을 특성화하기 위해 정상 배아 세포를 처음으로 사용했을 때, 질병 모델링을 위한 인간 배아 세포 유도는 엄청난 잠재력이 신속하게 실현되고 있음을 증명하였습니다. 정상적인 사람의 ES 세포는 Turner 증후군의 원인인 단핵구 X(monosomy X)에서처럼 배양액에서 aneuploid cell을 분리하여 염색체 장애(chromosomal disorder)를 모델링하는데에도 사용되고 있습니다. 그리고 특정 돌연변이 또는 염색체 이상을 갖는 인간 ES는 각각 착상 전 유전 진단(pre-implantation genetic diagnosis, PGD) 또는 착상 전 유전 스크리닝(pre-implantation genetic screening, PGS)을 통해 확인할 수 있습니다. 그렇지 않으면 폐기 되어버리는 이 ES는 단일 생성 또는 염색체 질환에 대한 ES 모델의 근원으로 사용될 수 있습니다. 그러나 인간의 ES에서 질병 모델을 생성할 수 있는 잠재력을 제한하는 PGD와 PGS는 소량의 질환만 추적할 수 있게 됩니다. 이러한 제한은 체세포 환자 유래 세포를 만능성으로 리프로그램을 할 수 있는 방법을 통해 극복되었습니다. 특정 전사 인자의 발현을 통해 체세포의 만능성 상태로의 리프로그래밍은 쥐 세포 및 인간 세포에서 처음으로 이루어졌으며 만능 줄기 세포 및 그 응용에 대한 연구에 일대 혁명을 가져왔습니다. 리프로그래밍 혹은 역분화된 세포를 유도 만능 줄기 세포(induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)라고 하며, iPSCs의 첫 번째 보고 직후 인간 iPSCs는 인간의 유전 질환 모델을 생성하는데 지속적으로 사용되어 왔습니다(그림 1). 최근 오랫동안 기다려온 체세포 핵이 탈핵된 난모 세포(enucleated oocyte)에 리프로그래밍 될 수 있는 인간 체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 성공 사례는 환자 세포로부터의 SCNT-배아 세포 형성을 이끌었습니다(그림 1). Nuclease 기반 지놈 편집 기술은 최근 몇 년 동안 큰 발전을 거듭하여 더욱 다기능화 되었으며, 인간 PSC를 사용하여 질병 모델을 생성하기 위해 유전자 편집을 다시 사용하도록 대중화되었습니다. 이러한 방법은 정상 및 질병 세포주에서의 유전자 녹아웃(knockout) 및 유전자 보정(correction)을 포함하여 PSC에서 부위별 유전적 변화를 도입할 수 있게 합니다. 이러한 접근법은 유전자좌 내에서 도입 된 변형에 의해서만 구별되는 유전적으로 일치된 인간 PSC 계통의 생성을 용이하게 하였습니다. 그리고 이러한 세포주는 표현형상의 차이가 특정 변이로 인해 더 많이 발생하는 고도로 제어된 시스템을 제공하며, 인간 PSC와 단일 및 복합성 장애 모두를 모델링하기 위한 지놈 편집의 사용이 점차 광범위해지는 데 도움이 되었습니다.

그림 1. Strategies for generating disease models using human pluripotent stem cells (PSCs).

• 질병 모델링에 대한 리프로그래밍의 영향

체세포를 만능성으로 리프로그래밍을 하는 것은 세포 치료 및 재생 의학에서 ES 세포의 면역학적인 문제로 인해 최근까지 서로 양립하기 어려웠습니다. 리프로그래밍이 환자 유래 iPSC를 통해 인간 유전 질환 모델링을 가능하게 함으로써 중개 연구(translational research)에서는 이 기술이 매우 유용한 도구로 사용되었습니다. 현재 특정 유전자에 의한 리프로그래밍을 유도하는 분자 메커니즘의 이해가 여전히 부족하지만, 리프로그래밍 과정은 매우 견고하고 다양한 세포 유형에서부터 여러 방법을 이용하여 새로운 iPSC 계통(태아기부터 노년기까지의 기증자)으로 유도할 수 있게 되었습니다. 그럼에도 불구하고 질병 모델로서의 분화능 및 유용성은 잠재적으로 지속성에 영향을 미칠 수 있는 잔류 체세포 후생 기억(residual somatic epigenetic memory)이 중요하게 여겨지고 있습니다.

환자 세포를 이용한 리프로그래밍은 인간 PSC로 질병 특이적 모델을 형성하는 다른 전략에 비해 몇 가지 장점을 갖고 있습니다. 여러 환자의 iPSC 유도는 다양한 유전적 배경에서 유사한 돌연변이를 분석할 수 있습니다. 또한 환자로부터 유도된 iPSC는 유전적으로 복잡한 질환을 모델링 할 때 정상 PSC에서의 지놈 편집보다 더 유용하게 사용되기도 합니다. 마지막으로, 환자에 따른 iPSC는 개별화된 의학의 맥락에서 치료 결정을 내리는데 도움이 될 수 있습니다. 국가적으로나 국제적 계획은 이미 인간 질병 모델로 인간 iPSC의 저장소를 확립하려는 것을 표 1을 통해 알 수 있습니다. 이 저장소는 센다이 바이러스 또는 에피솜 벡터(episomal vector)의 사용과 같은 비통합적 리프로그래밍 방법을 사용하여 단일 및 복합 질환 모두를 위해 수천 개의 새로운 세포주를 형성하는 것을 목표로 하고 있습니다. 1-3 세포주는 각 환자에서 파생되어 공공 저장소에 저장되며, 국내 및 국제 프로젝트에서 여러 조사의 컨소시엄과 함께 NYSCF (New York Stem Cell Foundation)와 같은 지역 이니셔티브(initiative)가 설립이 되었습니다. 특히 NYSCF는 iPSC의 자동화된 고효율 유도 및 분화 서비스를 지원하여 새로운 치료법을 지원하고 가속화하고 있습니다. 이러한 저장소의 목표는 대부분의 유전 질환에 대한 세포주를 제공하고 질병 모델링 및 약물 검사의 미래를 변화시켜야 하는 성과로 여겨지고 있습니다.

표 1. Large-scale initiatives for derivation of diseased iPSCs

3. 인간 만능 줄기 세포를 이용한 질병 모델링

인간 질병 연구를 위한 줄기 세포 기반 모델을 선택할 때는 몇 가지 기준을 고려해야 합니다. PSC 기반 모델은 단일 유전자(단일성 장애)에서 발생하는 질병을 연구하고, 높은 침투력(penetrance)을 나타내며, 발달 중 일찍 발병하고 명확한 세포 표현형(phenotype)과 관련이 있을 때 이상적이라고 할 수 있습니다. 이러한 특성은 PSC가 시험관 내에서 표현형을 예측하기에 충분하지만, 대조적으로, 일련의 유전자(복합 질환)에서 유래된 질병이 낮은 침투율을 나타내거나 늦게 발병하게 되는 경우가 존재합니다(즉, 성인기에만 나타남). 그리고 표적 장기의 비정상적인 형성을 포함하는 표현형과 관련된 질병은 다른 방법으로 더욱 표현하기 어렵기 때문에 PSC를 사용하여 모델링되는 경우가 있습니다. 더욱이, 일반적으로 PSCs를 사용하는 것은 동물 모델이 있거나 세포 특이적 분화 프로토콜이 부족할 때는 유리하지 못하지만, 이러한 문제 중 일부는 PSC를 특정 질병 모델링에 활용하기 위해 극복될 수 있는데, 유도된 세포 노화가 후기 발병 모델링에 사용되는 것이 하나의 예시로 사용됩니다.

• 단일 및 복합 질환의 모델링

일반적인 유전 질병은 PSC를 사용할 때, 그 모델을 만들 수 있는 방법을 결정짓는데 매우 중요한 역할을 합니다. 유전 질환은 크게 단일(monogenic), 염색체(chromosomal) 및 복합체(complex)의 세 가지로 나눌 수 있습니다. 염색체 질환은 염색체 또는 부 염색체 영역의 손실 또는 추가에 기인한 반면, 단일 유전 질환은 단일 유전자의 변경으로 발생하게 됩니다. 여러 유전자의 변경으로 인해 발생하거나 유전적인 근거가 명확하지 않은 질병은 일반적으로 복합성으로 이야기 됩니다. 이러한 차이에도 불구하고 PSC를 사용하여 앞으로 설명할 3가지 종류의 인간 질병이 성공적으로 모델링 되었는데, 여기에는 레쉬-니한(Lesch-Nyhan) 질병 및 연약 X 증후군과 같은 단일 생성 질환; 다운 증후군 및 터너 증후군과 같은 염색체 질환; autism spectrum disorder (ASD) 및 정신 분열증과 같은 복합 질환이 포함됩니다. PSC를 사용하여 모델링 된 많은 질병이 신경계 질환이지만, 상당수의 연구가 심장 질환과 같은 다른 질병 군에 중점을 둡니다. 중요한 세 가지 종류의 유전병은 관련 PSC 모델을 생성하는데 사용할 수 있습니다. 단일 유전 질환에 대한 인간 PSC 기반 모델은 질병 관련 유전자의 돌연변이에 의해 유발(유전자 편집 기술의 향상에 의해 촉진 됨)되거나, PGD 후 영향을 받는 배반포로부터 ES 세포를 분리하거나 체세포를 리프로그래밍함으로써 형성할 수 있습니다. 이 기술은 광범위하게 적용되어 점점 더 많은 셀 저장소를 생성합니다. 염색체 질환은 PGS 배아로부터 분리 된 ES 세포 또는 염색체 이상이 있는 ES 세포를 사용하거나 염색체 질환 환자의 체세포 리프로그래밍에 의해 모델링 되었습니다. Prenatally 또는 유전자 편집으로 쉽게 재현할 수 없는 복잡한 질병은 환자 세포- iPSCs 또는 SCNT-ES 세포의 리프로그래밍에 의해 모델링 됩니다.

복잡한 질병에 관한 또 다른 장애물은 유전적 교정(genetic correcton)입니다. 유전자를 타겟팅하거나 편집하는 기술은 매우 효율적이라고 알려졌지만 소수의 유전자만 가능한 것처럼 제한됩니다. 따라서 식별되어야 할 유전자의 변이가 있는 복잡한 질병은 단일 발생 질환과 같은 방식으로 교정될 수 없습니다. 중요한 것은 복잡한 질병이 인간 PSC를 사용하여 성공적으로 모델링 되고 있다는 것입니다. 그러나 동일한 질병이 단일 유전자 또는 다중 유전자의 돌연변이로 인해 발생할 수 있는 경우, 많은 연구자들은 특별한 이유 때문에 널리 퍼진 복잡한 형질보다는 희소한 단일형을 모델링 하기를 선택하게 됩니다. 예를 들어 슈퍼 옥사이드 디스뮤타제 1(Superoxide dismutase 1, SOD1)의 돌연변이가 있는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 모델 또는 파킨 RBR E3 유비퀴틴 단백질 리가제의 돌연변이가 있는 파킨슨병 모델을 분석하는 것이 포함됩니다. 진행 중인 연구로는 동일한 질병의 단일 발생 및 복합 증례를 비교하는 연구가 있습니다. 가장 일반적인 신경 퇴행성 질환인 알츠하이머의 복잡한 유전적학적인 문제에 대한 연구는 그러한 질병에 걸리기 쉬운 돌연변이에 대한 연구입니다. 이 sortilin 관련 수용체 1 (sortilin-related receptor 1, SORL1) 유전자는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)을 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주성분인 아밀로이드 - 베타(Aβ)로의 프로세싱을 조절하는 신경 세포 아포 리포 단백질 수용체를 코딩합니다. 알츠하이머에서 SORL1 발현의 소실이 보고되었지만 SORL1 변이가 이 유전자의 조절에 어떻게 영향을 미치는지는 알 수 없었습니다. 최근에, 미확인된 돌연변이를 가진 알츠하이머 환자의 iPSC 유래 뉴런은 복합 알츠하이머 병에서 SORL1 변이체의 역할을 조사하기 위해 사용되어 왔습니다. 건강한 개인과 알츠하이머 환자의 분화된 신경세포에서 뇌 - 유도 신경 인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)는 SORL1 발현을 유도하여 결과적으로 Aβ 수준을 감소시킵니다. 이 반응은 SORL1의 5' 말단에서 유전자 변이체의 발생과 상관 관계가 있었고, 따라서 이것은 보호적 하플로타입(haplotype)으로 정의되었습니다. 대조적으로, 위험 관련 SORL1 일배 체형은 BDNF 치료에 반응하지 않아 잠재적 인 긍정적인 효과를 막았지만, 이러한 관찰은 알츠하이머 병의 복잡한 유전 적 특성을 입증했으며, 동일한 변종이 건강한 사람과 병이 있는 사람 모두에게 나타난다는 사실을 밝혔습니다. 또한, 이 연구는 SORL1을 통해 Aβ 펩타이드의 축적을 직접적으로 바꿀 수 있기 때문에 알츠하이머에서 neurotrophins의 역할을 확인할 수 있었습니다. 어떤 질병에서는 동일한 유전자의 다른 돌연변이가 또 다른 장애를 일으키는데, 예를 들어, 심장 부정맥 장애 Brugada 증후군(Brugada syndrome, BrS)과 long QT syndrome 3 (LQT3)은 SCN5A 유전자의 다른 돌연변이와 관련이 있습니다. 더욱이, SCN5A의 특정 돌연변이 대립유전자는 두 증후군 모두를 유발할 수 있습니다. 이 돌연변이를 지닌 환자의 iPSC에서 분화된 심근 세포는 두 증후군의 특징인 전기 생리 학적 이상을 재발견하게 되었습니다.

• 초기 그리고 후기에 발병하는 장애 모델링

일부 인간의 유전 질환은 태아 발달이나 유아기에 나타나는 반면에 다른 유전 질환들은 성인기에 나타나는 경우가 있습니다. ES 세포는 초기-임플란트 인간 배아에서 유래 되었기 때문에 초기 배아 세포 신원을 대표하게 됩니다. 더욱이, PSC로부터 분화된 몇몇 세포 유형은 성인 세포보다는 태아와 유사한 경우가 많습니다. 따라서 PSC 기반 모델은 발달 장애 또는 초기 질병 발병 장애 연구에 적합하며 그 중 일부는 실행이 어려운 예가 있습니다. 그 예로 배아 발생에 영향을 미치고 높은 수준의 유산을 일으키는 터너 증후군 및 다운 증후군이 있는 것으로 알려졌습니다. PSC를 사용하여 모델링된 많은 유전 질환은 초기 아동기에 진단됩니다. IKK 복합체 관련 단백질(IKK complex-associated protein, IKBKAP) 유전자의 돌연변이로 인한 치명적인 가족성 자율 신경계 장애는 감각 및 자율 신경 세포의 광범위한 퇴행을 초래하며 아동기에 나타나는 증상을 보입니다. 환자 유래 iPSC는 IKBKAP의 조직 특이적 비정상 접합을 밝혀 내고 접합 조절제는 신경 분화 및 이동 결함을 완화시킬 수 있습니다.

후기 발병 장애를 모델링하기 위해서는 PSC와 그 파생물의 배아성이 극복되어야 하며, 따라서 시험 관내에서 세포 노화를 촉진해야 합니다. 어떤 경우에는 초기에 발병하는 질병 변이가 가능한데, 가장 흔하게 나타나는 연령 관련 신경 퇴행성 질환 중 하나인 파킨슨병은 도파민 신경 세포의 점진적인 소실을 특징으로 합니다. 복잡한 유전적 문제를 가지고 있다고 생각되지만, 알파 - 시누 클레인(synuclein) 유전자의 3배를 더 발현하는 파킨슨병 환자들은 초기에 공격적인 증상을 나타내는 것으로 알려졌습니다. 이러한 환자에서 유래된 iPSC는 도파민 신경 세포에 대한 iPSC 분화 후, 시험관 내에서 질병 특이적 표현형을 확인하는 연구자를 가능하게 했습니다.

긴 분화 프로토콜은 뉴런 및 간세포를 포함하여 일부 성숙된 세포 유형을 얻기 위해 사용될 수 있습니다. 그러나 PSC-유래 뉴런을 구별하기 위한 장기간(최대 6개월)의 복잡한 프로토콜에서도 태아 기능을 가진 뉴런을 생성할 수 있습니다. 하지만 많은 후기 발병 모델을 모델링하는 것은 이러한 분화 프로토콜에 의존하고 생체 외에서 질병 특이적 표현형을 보고한다고 알려졌는데, 그 예로, PARK2에서 돌연변이를 갖는 파킨슨병 환자로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 뉴런은 이상 형태 및 신경 프로세스의 복잡성을 감소시킨다고 합니다. 과산화수소, MG-132 및 콘카나마이신 A (concanamycin A)와 같은 스트레스 물질은 PSC 모델에서 파킨슨병의 노화와 유사한 특징을 유도하는데 사용되어 왔습니다. 그러나 대조군과 병이 있는 세포가 스트레스 요인에 대해 차이가 있지만, 이들을 사용한 대부분의 연구에서 나이와 관련된 특징을 측정하지 않았기 때문에 이러한 치료가 실제로 세포 노화를 모방하는지 명확하지 않습니다.

노화를 유도하기 위한 대안적인 접근법은 초기 노화 장애에 대한 통찰력을 이용하여 노화와 관련된 마커를 특별히 목표로 삼는 것입니다. Hutchinson-Gilford progeria 증후군에 관여하는 lamin A 단백질의 절단된 형태인 Progerin 은 최근에 파킨슨 병 iPSC 유래 뉴런에서 세포 노화를 촉진시키기 위해 외인성으로 발현되었다는 사실을 밝혀냈습니다. 핵의 모양이나 형태, 이색질 마커(heterochromatin)의 발현 및 DNA 손상과 같은 세포 연령과 관련된 마커는 파킨슨병 환자의 섬유 아세포에서 처음 측정되었습니다. 이러한 마커는 리프로그래밍 후 사라지고 뉴런 또는 섬유 아세포로의 분화 후에 다시 나타나지 않았습니다. 그러나 이러한 마커는 progerin에 단기간 노출된 후에 유발되어 세포 노화를 암시합니다. Progerin 발현은 수상 돌기 변성, 나이와 관련된 neuromelanin 발현 및 미토콘드리아 팽창과 같은 형태학적 특징과 같은 파킨슨병 관련 phenotypes을 확인했습니다. 따라서 후기 발병 질환의 연구에서 본질적으로 미성숙한 PSC의 한계를 극복하기 위해 몇 가지 전략이 사용되고 있습니다. 그 방법은 질병 기원과 진행에 대한 보완적인 표현형과 통찰력을 산출합니다.

• 후성 질환 모델링

대부분의 유전 질환은 유전적 결함과 관련되어 있지만, 특정 질환은 완전히 후성 유전으로 정의 될 수 있습니다. 상속된 후성 유전 질환은 종종 후성 유전 조절과 직접 관련이 있는 DNA 서열의 유전적 변화를 수반하는데, 예를 들어, DNA 메틸화에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이는 면역 결핍, 혈전 형성 장애 및 얼굴 이형 증후군 I형에서 관찰되는 바와 같이 전체적으로 광범위하게 영향을 미칠 수 있습니다. De novo DNA 메틸 전이 효소 3B(DNMT3B) 유전자 결핍으로 인해, 환자 유래 iPSCs 및 분화된 세포 유도체는 유전자 발현 프로파일의 변화뿐만 아니라 자소관 및 지방 세포 부위의 DNA 메틸화를 나타냅니다. 이 두 가지 특징은 이 질병과 관련된 유전적 불안정성 및 생리학적 결함에 기여할 가능성이 높은데, 중요한 것은, DNMT3B는 인간 PSC에서 매우 활성이지만, 리프로그래밍 및 만능성에 필수적인 것은 아니므로, 초기 발달의 맥락에서 ICF 유형 I의 병인학을 연구할 수 있다는 것입니다. 후성 유전 질환의 또 다른 부류는 부모 유전체 각인(parental genomic imprinting)과 관련된 것으로, 부모 특유의 후성적 변형이 분화하여 근접성 유전자의 대립유전자 특이적 발현을 일으키는 과정을 말합니다.

최근까지 인간 병리학의 후성학적 기초연구를 진행하는 것은 선재적인 후성 유전 상태를 가지고 있는 세포에 크게 의존해 왔습니다. 원칙적으로 이러한 연구는 PSC에서 'epigenome editing' 을 통해 수행될 수 있는데, 지놈 편집에 사용되는 것과 동일한 분자 도구가 염색질 변경자를 모집하고 유전자좌별 방식으로 후성 수정을 변경하도록 설계되었습니다. 이러한 접근법을 통해, 배양 또는 리프로그램시 부여될 수 있는 예기치 못한 후성적 변화의 간섭을 피하면서 제어된 환경(예를 들어, 등 원성 PSC 계통)에서, 원하는 후성적 변이를 직접 유도하는 것이 가능할 수 있게 됩니다.

4. 고급 배양 기술을 이용한 모델링

많은 질병이 시험관 내에서 단일 세포 유형을 사용하여 모델링 될 수 있지만, 일부 질병에는 보다 진보 된 배양 기술이 필요합니다. 뉴런과 신경 교세포의 공동 배양을 사용하여 ALS를 모델링함으로써, 척수 운동 신경은 돌연변이 SOD1 유전자를 갖는 신경 교세포의 독성 영향에 선택적으로 민감하다는 것이 밝혀졌습니다. 이 효과는 이 모델의 특이성을 확인하면서 돌연변이 SOD1을 발현하는 섬유아 세포와 함께 뉴런을 배양할 때 명확한 효과를 갖지 않다는 점은 흥미롭다고 할 수 있습니다.

서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용은 3 차원(3D) 조직 구조를 연구함으로써 좀더 이해할 수 있습니다. PSC에서 유래한 여러 조직의 유기체가 배양액에서 형성되어 분자 세포 및 생리학적 표현형의 생체 외 분석은 물론 발생 및 질병과 관련된 구조적 특징을 이해할 수 있기 때문입니다. 3D 구조의 예로는 눈과 뇌하수체의 발달과 대뇌와 장의 organoids의 생성을 반복하는 것들이 있습니다. 또한 소두증과 낭포성 섬유증을 모델링하는데 사용되어 질병 관련 표현형을 밝혀냈습니다. 낭포성 섬유증 환자의 iPSC에서 유래된 장 기관을 사용하여 forskolin에 대한 반응으로 비정상적인 팽창과 같은 질병 특이 현상을 재현하였습니다. 이 모델은 체외 수정시 낭포성 섬유증의 진단과 개별화된 약물의 개발을 가능하게 합니다.

5. ES 세포와 iPSC의 모델 비교

인간의 유전 질환의 모델은 모든 유형의 PSC에서 형성 시킬 수 있습니다(그림 1). 첫 번째 모델은 ES 세포에서 생성되었지만 일단 iPSC 기술의 발전으로 사용 가능해지면서 PGD 유래 ES 세포의 이용 가능성이 빠른 속도로 제한되었습니다. 두 가지 세포가 다른 기원임에도 불구하고, iPSCs는 유사한 마커를 표현하고, 자체 재생 능력(self-renewal)을 보유하며, 체외 및 생체 내에서 3개의 배아 배아 층으로 분화된다는 점에서 ES 세포와 매우 유사합니다. 그럼에도 불구하고 iPSC에서 유래한 체세포의 후성 기억의 지속성, 차별적 DNA 메틸화 signatures 및 다른 정도의 유전적 이상을 포함하여 PSC의 두 가지 유형 간에는 몇 가지 차이점을 지니고 있습니다.

6. PSC를 이용한 약물 치료

인간의 질병 모델에 대한 주요 동기 중 하나는 질병을 완화시키거나 치료법을 개발하는 것입니다. 동물 모델은 약물 스크리닝에 자주 사용되지만, 위에 서술한 것과 같이, 대부분 질환에 적합한 동물 모델이 없는 것이 현실입니다. 또한 소분자 라이브러리의 고효율 스크리닝 (high-throughput screening, HTS)을 위한 동물 모델의 사용은 일반적으로 적합하지 않습니다. 따라서, PSC 질병 모델의 사용은 약물 발견을 위한 목적으로 점차 선호되고 있습니다.

• PSC를 이용한 약물 스크리닝 전략

동물 모델을 연구하는 것과 마찬가지로, PSC를 사용한 치료법 개발의 첫 번째 단계는 치료해야 할 표현형을 확인하고 정의하는 것입니다. 이 단계는 표현형의 일부만이 나타나고 일반적인 배양에서 특정 세포 유형에 대한 분화가 필요한 시험관 내 질병 모델에서 잘 설명될 수 있습니다(그림 2). 일단 치료 될 표현형이 밝혀지면 잠재적 약물을 확인하는 두 가지 주요 전략이 있습니다.

후보 약물 접근법에서는 작고 잘 정의 된 화합물 그룹(small and well-defined group)이 세포에 처리되게 됩니다. 후보 약물 접근법은 환자 맞춤형 iPSC 라인이 확립되면 세포를 분화시켜 가장 강력한 치료법을 확인하기 위한 일정한 약물 세트를 테스트하게 되는데 사용될 수 있기 때문에 개별화된 의약의 개발이 될 수 있었습니다. 이 접근법에는 새로운 iPSC 모델에서 기존 약물의 확인이 포함되며, 규제 기관에 의해 승인 된 약품을 새로운 질병 모델에서 즉시 검사할 수 있게 하여 환자에서 임상 사용 전에 조기 검진 결과를 신속하게 제공할 수 있게 합니다(그림 2).

이와는 다르게 HTS는 연구당 백만 개 이상의 화합물을 한번에 검사할 수 있기 때문에 약물 발견을 시작하기 위해 사전 지식이 필요하지 않습니다. 그러나 HTS는 자동으로 측정되고 정량화를 요구하는 한계가 있습니다. 이것은 세포 생존율을 다루거나 단백질 리포터 유전자와 같이 쉽게 관찰할 수 있는 단백질 발현을 처리할 때 유용하지만, 모델링된 질병보다 복잡한 표현형(예: 전기 생리 학적 결함)에는 유용하지 않습니다. 또한 광범위한 화합물을 테스트하기 위해서는 많은 수의 세포가 필요하기 때문에 세포가 긴 처리 과정을 필요로 하거나 분화 효율이 낮을 때 특히 어려움이 겪게 됩니다. 후보 약물 접근법은 훨씬 적은 수의 세포가 필요하며 복잡한 표현형 변경을 평가하는데 사용할 수 있습니다.

그림 2. Drug development strategies using human induced pluripotent stem cells (iPSCs).

최근 연구에서는 HTS와 집중적인 후보자 분석을 모두 사용하여 각 접근법의 장점을 활용했습니다. 예를 들어, Barmada et al. (Nat. Chem. Biol. 10, 677–685, 2014)은 처음에는 병에 걸린 마우스 뉴런에 대해 스케일이 큰 HTS를 수행 한 다음, ALS 환자 파생 iPSC와 분화된 운동 뉴런 및 성상 세포(astrocytes)에서 선택된 화합물을 선발했습니다. 두 가지 접근법 모두가 약물 개발의 첫 단계에 불과하다는 점은 중요한 점입니다. 이 접근법이 체외 모델을 활용할 때, 대부분의 경우 HTS와 새로운 후보 약물 접근법이 임상적 맥락에서 적용되기 전에 광범위한 안전성 평가가 필요하기 때문입니다.

• 신경 장애와 관련된 약물 발견

많은 종류의 질병이 iPSC 유래 세포를 사용하여 모델링 되었지만, 신경 장애의 경우 약물 발견에서 iPSC 세포를 이용하는 대표적인 사례라고 할 수 있습니다. 이 다양한 질병에는 조기 및 후기 발병 질환, 중추 및 말초 신경계에 영향을 미치는 여러 세포 유형 및 장애에 나타나는 여러 종류의 유전 질환이 포함되며, 또한 세계 인구의 연령이 증가함에 따라 향후 수십 년 동안 두 배가 될 것으로 예상되는 60세 이상의 인구 수가 증가함에 따라 신경 퇴행성 질환의 확산은 그에 따른 해결책과 새로운 치료법을 필요로 하게 됩니다. 이 질환의 스펙트럼을 평가하자면 iPSC 기반 질병 모델링 및 약물 발견의 최신 경향에 대한 스냅샷을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 비정상적인 표현형을 성공적으로 치료하기 위해 환자에서 유래된 분화 iPSC를 사용한 연구를 논의하고자 합니다(그림 3, 표 2). 약물 개발을 위한 플랫폼으로 iPSC 유래 뉴런을 사용하는 것은 인간 섬유 아세포 리프로그래밍이 발견된 지 2년 만에 시작되었으며(Nature 461, 402–406, 2009), 표 2에서처럼 iPSC에서 유래된 신경 세포를 이용하여 모델링 한 25개의 신경 질환을 확인할 수 있습니다.

그림 3. Evaluation of drug screening studies using patient-derived induced pluripotent stem cell (iPSC) models for neurological disorders.

배양단계에서 분화된 뉴런은 일반적으로 미성숙한 배아 뉴런과 비교할 수 있지만, 이들 질병 모델링 연구의 절반 가까이는 후기 발병(late-onset)에 초점을 맞추고 있습니다. 즉, 이러한 질병이 생후 매우 늦게 나타난다고 하지만, 비정상적인 세포, 분자 및 전기 생리학적 표현형은 배양단계에서 검출이 가능해야 치료 가능하다고 볼 수 있습니다. 흥미롭게도, 대부분의 연구는 단일 유전자 또는 염색체 이상이 있는 환자의 세포에서 수행되었으며 복잡한 유전 질환이 있는 환자는 수행되지 않았습니다(그림 3). 비록 알츠하이머 병과 ALS의 대부분의 경우가 단일 유발을 가지고 있지 않지만, 이러한 질병을 모델링하는 많은 연구가 여전히 단일 유전자에서 돌연변이가 있는 환자의 섬유 아세포를 이용합니다. 대부분의 연구는 HTS를 실행하는 대신 분화된 세포에서 후보 약물의 제한된 스크리닝만을 수행합니다. 이 연구의 약 1/3은 iPSC 기반 모델을 사용하여 기존 약물의 효과를 검증합니다. 이러한 실험을 선호하는 이유는 규제 의약품을 사용할 때 시험관 내 모델에서 임상 시험으로의 신속한 전환이 가능하기 때문입니다. 흥미롭게도, 소분자의 잠재적인 약물 및 HTS와 함께, 변형된 올리고 뉴클레오타이드 또한 특정 서열을 표적화하는데 사용됩니다. 이 방법에서는, 안티센스 올리고 뉴클레오타이드의 이상 유전자의 상보적인 mRNA 서열에 결합하여 효과적으로 이를 불활성화 시키게 됩니다. 이 방법은 유전자 특이적인 서열을 쉽게 합성 할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 내 전달 방법이 현재 개발되고 시험되고 있기 때문에 유망하다고 할 수 있습니다 (Adv. Drug Deliv. Rev. 87, 90–103, 2015).

표 2. Drug screening for neurological diseases using patient-derived induced pluripotent stem cell models

마지막으로, 진정한 도전은 HTS를 사용하여 편견 없이 새로운 치료법을 찾는 것이라고 생각됩니다(그림 2). 이러한 스크리닝 방법은 이미 여러 실험실에서 시작되었지만, 이렇게 찾은 약물의 대부분은 세포 및 동물 모델에서 전임상 시험을 포함하여 안전성 평가에 사용해야 되는 문제점을 지니고 있습니다. 그러나 동물에서 재현될 수 없는 질병의 경우 인간 PSC을 이용한 실험에서 임상 실험으로 직접 이동하는 것이 합리적일 수 있습니다.

7. 전망

PSC 기반 치료의 밝은 미래에도 불구하고, 이의 잠재력과 실제 사용에 있어서는 여전히 상당한 장애물을 지니고 있는 것이 현실입니다. 미래에 우리는 monogenic, chromosomal or complex와 같은 사실상 모든 유전병의 모델링을 가능하게 할 PSC의 저장소를 보유할 것으로 기대합니다. 이를 위한 첫걸음은 관련 유전자 돌연변이 유도 또는 교정과 함께 동질성 세포주를 생성하는 것입니다. 때로는 동일한 유전자에서 다른 돌연변이가 존재하는 경우가 있는데, 유전적으로 복잡한 질환에서, 환자 유래 iPSC의 사용은 질병에 관여하는 것으로 의심되는 여러 유전자의 돌연변이 유도를 확인하는데 매우 유용하게 사용될 수 있습니다. 세포 특이적 장애를 모델링하는 능력은 특히 강력하고 효율적인 분화 프로토콜에 달려있습니다. 우리는 일부 세포 유형에 대해 성숙하고 기능적인 세포를 얻을 수 있는 능력을 가지고 있지만, 여전히 다른 사람에게는 실질적인 장애물이 되기도 합니다. 세포 배양 및 분화 프로토콜의 최적화와 더불어 핵산 및 아미노산 기반 약물뿐만 아니라 저분자를 이용한 치료법에 대한 스크리닝은 이런 점에서 매우 기대된다고 할 수 있습니다. 또한 우리는 이전에 승인된 약물을 사용하여 배양된 약제에 대한 많은 임상 시험을 기대 할 수 있습니다. 질병에 적절한 동물 모델이 없는 경우 안정성이 입증된 치료법이 배양 디쉬에서 환자에게 직접 시행될 가능성이 있기 때문입니다. 많은 추가 작업이 필요하지만 최근의 발전과 중요한 연구 결과로 인해 수많은 질병을 모델링하고 치료하는데 있어 PSC를 사용함의 가치는 그 미래가 밝다고 할 수 있습니다.

...................(계속)

출처 : 생물학연구정보센터(BRIC)   (바로가기)