CircRNA의 생성과 기능

[요약문]

CircRNA(원형 RNA, circular RNA)는 수천 개의 진핵생물 유전자의 전구체 mRNA로부터 백스플라이싱(back-splicing)을 통해 생성된다. CircRNA는 발현량이 일반적으로 낮은 수준으로 유지되지만, 최근 세포 종류와 조직에 따라 특이적인 발현량이 보고되면서 이에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 게다가 circRNA가 스플라이싱(splicing)과 전사 과정을 조절하는 miRNA(마이크로 RNA, microRNA)와의 상호작용 의해 다른 유전자의 발현을 조절함으로써 진핵생물 전사체(tranome)의 복잡도와 다양성에 기여한다는 사실이 밝혀지고 있다.

본 자료는 The biogenesis and emerging roles of circular RNAs. Nature reviews Molecular cell biology 17.4 (2016): 205-211.의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

[목 차]

1. 서론
2. CircRNA의 광범위한 발현
3. CircRNA의 생성
4. CircRNA의 유전자 조절
5. 결론

1. 서론

CircRNA는 공유 결합으로 연결된 단일 가닥의 전사물(tran)로 다양한 종류가 존재한다. CircRNA의 한 종류가 mRNA 전구체의 백스플라이싱으로부터 만들어진다는 것은 고등 진핵생물에서 20년 전에 발견되었다. 그러나 그 이후로는 소수의 circRNA만이 발견되었으며, 기능이 없는 부산물로만 여겨졌다. 최근 차세대 RNA-seq(RNA 시퀀싱, RNA sequencing) 기술을 전사체에 적용하여 통해 circRNA가 다양하게 발현되어 있음을 확인할 수 있었다. 예를 들어, 적용된 세포와 조직에서 발현되는 유전자의 10% 이상이 circRNA를 생성할 수 있었다.

CircRNA는 엑손(exon)의 백스플라이싱으로 생성된 mRNA 전구체에서 만들어진다고 여겨져 왔으며, 3’과 5’위치에 인산화 결합으로 연결된 원형 형태로 나타난다. 원형 형태가 어떻게 형성되는지에 대한 최근 연구 결과는, 스플라이세오좀(spliceosome)에 의해 백스플라이싱이 일어나며 cis와 trans 조절자 모두에 의해 영향을 받는다는 사실을 제시한다. 대부분의 circRNA의 기능이 알려져 있지 않지만, 현재 진행 중인 연구에 따르면 일부 circRNA가 유전자 조절에 있어 중요한 역할을 할 가능성이 있음이 드러나고 있다. 본 논문에서는 광범위하게 발견되는 circRNA에 대한 최근 연구 결과들을 살펴보며, 그들의 생성과 유전자 발현에서의 잠재적 기능을 논의한다. 또한 미래의 연구를 위한 주요 과제들을 제시한다.

2. CircRNA의 광범위한 발현

 다양한 유형의 circRNA가 생성되는 메커니즘이 밝혀지고 있다(박스 1). 엑손의 mRNA 전구체 백스플리싱으로 형성된 circRNA는 염기 A가 연속적으로 달린 꼬리(poly(A) tail)rk 없기에 폴리아데닐화(polyadenylated) RNA 프로파일링으로는 잘 관찰되지 않는다. 최근 비폴리아데닐화 전사체 또는 선형의 RNA는 분해하면서 원형의 RNA는 보존하는 RNase R 효소를 처리한 결과로 circRNA 연구가 많이 이루어지게 되었다. CircRNA는 벼(Oryza sativa)와 애기장대(Arabidopsis tha-liana)를 포함한 식물뿐만 아니라 균류나 원생생물에서도 발견되었다.

진핵생물 수천 개의 유전자 위치에서 엑손의 백스플라이싱으로 인해 원형으로 형성되는 circRNA는 그 외에도 여러 메커니즘에 따라 다양한 종류로 생성된다.

① 원형의 바이러스 RNA 지놈에서 숙주 세포 효소에 의해 3’과 5’위치 또는 2’과 5’ 위치에 인산화 결합을 형성하여 만들어진다.
② 고세균과 조류(algae)의 경우 circRNA는 rRNA와 tRNA 생성과정 도중에 만들어질 수 있다.
③ snoRNA(소핵소체 RNA, small nucleolar RNA)와 리보자임(ribozyme) RNase P와 같은 여러 하우스키핑 (housekeeping) 비번역(non-coding) RNA들도 고세균에서는 원형의 형태로 발견된다.
④ 인트론(intron)과 엑손의 스플라이싱 과정 중에 다양한 circRNA이 관찰되었다. 예를 들어 그룹 I과 그룹 II의 인트론의 자가 스플라이싱은 3’과 5’ 위치 또는 2’과 5’ 위치에 인산화 결합을 통해 circRNA를 형성한다.

CircRNA는 낮은 발현 정도로 인해 기존에는 단지 스플라이싱 과정의 부산물로 취급되었다. 그러나 약 50개의 유전자는 선형의 형태보다는 circRNA로 더 많이 존재하고 있다는 것이 여러 세포주(cell line)에서 확인되었으며, 세포와 조직의 종류에 따라 높게 발현되고 있다는 것이 밝혀졌다. 게다가 수천 개의 circRNA가 뇌에 축적되어 있고, 수백 개의 circRNA가 EMT (epithelial?mesenchymal transition) 과정에서 높게 발현되고 있다. 또한 circRNA와 이에 대응되는 mRNA 사이에는 뚜렷한 상관관계가 나타나지 않았다. 이러한 연구는 일부 세포나 조직에서 관측된 더 높은 circRNA 발현량이 단순히 증가된 전사의 부산물이 아니며, 따라서 특별한 기능을 가짐을 시사하고 있다. 그러나 유전자 범위의(genome-wide) 분석에서 circRNA의 발현량이 그들의 선형 형태보다 더 세포 특이적으로 나타나지는 않았다. 따라서 circRNA의 발현량을 결정하는 세포와 조직의 종류에 대해서는 완전히 규명되지는 않았다. 또한 circRNA의 구조가 안정된 형태이며 세포의 분열 속도에 따라 서로 다른 발현량을 보인다는 사실은 흥미로운 연구 질문으로 남아있다.

3. CircRNA의 생성

CircRNA는 RNA 중합 효소 II (Pol II)에 의해 전사되는 mRNA 전구체에서 유도된다. CircRNA의 생성은 기본적으로 스플라이싱을 조절하는 cis- 조절인자와 trans- 전사인자에 의해 영향을 받게 된다. 
 
• 스플라이세오좀에 의한 생성

 백스플라이싱 과정을 처리하기 위해서는 일반적인 스플라이세오좀 복합체가 필요한 듯 하다. CircRNA를 발현할 수 있는 벡터(vector)를 활용한 돌연변이 유발(mutagenesis) 실험을 통해서 엑손의 원형화가 효과적으로 일어나려면 엑손의 일반적인 스플라이싱 위치가 노출되어야 한다는 것이 알려졌다. 하지만 백스플라이싱의 메커니즘이 아직 명확히 밝혀지지 않았으며, 백스플라이싱의 효율은 일반적인 스플아이싱에 비해 상당히 낮게 관찰되었다. 백스플라이싱의 낮은 효율성은 아마도 스플라이세오좀이 3’ 위치 위쪽을 5’ 위치 아래쪽과 연결하는 효소 작용의 정도가 낮기 때문일 것이다. 스플라이세오좀이 백스플라이싱 과정에 작용하는 정확한 메커니즘은 향후 연구에서 밝혀져야 할 것이다.

• Cis 작용에 의한 circRNA의 형성

 대부분 circRNA는 여러 엑손으로 형성되며 통상적으로 2~3개를 포함한다. 백스플라이싱을 위해서는 엑손의 스플라이스 위치 주변의 특정한 서열정보가 필요하지는 않은 것 같다. 게다가 circRNA 내에 인트론은 존재하는 경우도 있고 그렇지 않은 경우도 있으며, 똑같은 유전자에서 선택적 스플라이싱(alternative splicing)으로 형성될 수도 있다. 백스플라이싱에 필요한 최소한의 엑손 길이가 존재하는지는 아직 밝혀지지 않았다. 그리고 단일 엑손에서 circRNA를 형성하는 엑손의 길이가 여러 개의 엑손을 포함하는 circRNA를 형성하는 엑손보다 훨씬 길다는 것이 관찰되었다.

• RNA 결합 단백질에 의한 조절

Cis 작용 외에도 RNA 결합 단백질(RNA-binding protein, RBP)이 circRNA의 생성을 조절한다는 것이 보고되었다. 흥미롭게도 초파리 D. melanogaster의 경우, 스플라이싱 인자인 Mbl (Muscle-blind)가 mRNA 전구체의 circRNA의 생성을 조절할 수 있다. 인트론 내에 존재하는 다양한 Mbl 결합 부위가 알려졌으며, Mbl의 과발현이나 인트론에서 Mbl 결합 부위를 추가할 경우 엑손의 원형화를 촉진하는 실험 결과를 볼 때, Mbl이 circRNA의 형성을 촉진시키는 기능을 한다고 생각된다. mRNA 전구체와 결합하여 circRNA 형성을 현저히 증가시키는 또 다른 RBP는 QKI (quaking)이다. 많은 circRNA는 EMT 과정에서 QKI에 의해 발현량이 증가하며, 이는 세포의 종류에 따라 circRNA가 의도적으로 조절될 수 있음을 의미한다. 인위적으로 합성 QKI 결합 부위를 인트론에 삽입하는 실험을 통해 circRNA 생산의 증가도 확인되었다. QKI는 이합체(dimer)를 형성하므로 아마도 2개의 인트론에 동시에 결합할 수 있고, 따라서 원형화를 이루는 엑손을 가까이 오게 만들어서 circRNA의 생산을 증가시키는 것으로 생각된다.

4. CircRNA의 유전자 조절

 일반적으로 CircRNA의 발현 수준이 낮다는 것은 진핵생물 전사체에서 만들어진 부산물일 뿐이라 여겨졌으며, 지금까지 대부분의 circRNA는 기능적 중요성이 없어 보였다. 그러나 최근의 연구들은 몇몇 CircRNA가 중요한 생리적 기능을 할 수도 있고, 여러 단계에서 유전자 발현을 조절할 수도 있다는 사실을 밝혔다.

• CircRNA는 miRNA와 상호작용 한다.

발견된 백스플라이싱 circRNA의 대다수는 주로 세포질(cytoplasm)에 위치하고 있다. 실험적으로 IRES (internal ribosome entry site)에 주입된 circRNA는 전사 과정을 돕는 듯 하지만, 자연적으로 circRNA가 리보솜 안에 결합하여 존재하는 것이 보고된 적은 아직까지 없다. 그리고 RNA 간섭(RNA interference)에 의해 circRNA가 표적이 될 수 있다는 관찰 결과는 더 안정적인 circR-NA가 세포질에서 miRNA 결합을 위해 mRNA와 경쟁하여 유전자 발현을 조절한다는 것을 시사한다. 이 모델을 지원하는 가장 대표적인 사례는 ciRS-7 (circular RNA sponge for miR-7)으로 척추동물의 CDR1 (cerebellar degenerationrelated 1) 유전자로부터 생성된다. ciRS-7는 인간과 쥐의 뇌에서 많이 발현되며 60개 이상의 miR-7 결합 부위를 포함하고 있다. 하지만 인간과 쥐의 circR-NA 내부에서 miRNA 결합 부위가 항상 발견되는 것은 아니기에, circRNA가 일반적으로 miRNA 스폰지(sponge) 기능을 수행하는 것은 아닐 것이다.

• CircRNA는 전사를 조절한다.

대부분의 circRNA는 세포질에 위치해 있지만, 인트론을 포함하는 circRNA는 사람 세포의 핵 안에서만 주로 발견된다. CircRNA의 핵 내부 또는 외부로의 이동을 조절하는 방법이 무엇인지는 아직까지 불분명하게 남아 있다. 인트론을 포함하고 있는 많은 선형 RNA 역시 핵 안에서만 발견되기에, 인트론을 포함하는 circRNA도 비슷한 방식으로 gor 내부에 유지될 것이다.

최근 핵 내부 circRNA는 Pol II의 전사를 돕는다는 연구가 이루어졌다. 이 연구에서 저자들은 Pol II와 결합하는 비번역 RNA를 연구하기 위해 RNA 면역 침강 분석(immunoprecipitation assay)을 수행했다. 그 결과 인트론을 포함하여 백스플라이싱된 EIciRNA (exon–intron circRNA)가 Pol II와 결합한다는 사실을 발견하였다. 예를 들어 EIciEIF3J 또는 EIciPAIP2와 같은 EIciRNA들의 발현을 넉다운(knockdown)시키면 연관된 유전자의 발현 역시 감소하게 된다. EIciRNA는 U1 snRNP 및 이들의 인코딩 유전자 프로모터와 함께 상호작용한다. EIciEIF3J와 EIciPAIP2는 각각 그들의 인트론 U1 snRNA가 결합할 수 있는 부위를 가지고 있다. 이러한 RNA간의 상호작용을 방해하면 EIciR-NA와 Pol II의 결합이 저해되고, 따라서 EIciRNA와 U1 snRNP의 복합체가 프로모터와 결합이 저해되어 EIF3J (eukaryotic translation initiation factor 3J), PAIP2 (poly(A)-binding protein-interacting protein 2)와 같은 연관된 유전자의 발현이 감소하게 된다.

• CircRNA는 스플라이싱에 영향을 준다.

CircRNA는 일반적으로 단백질 코딩 유전자의 중간 엑손 부분에서 생성된다. 따라서 circRNA의 생성과정은 mRNA 전구체의 선택적 스플라이싱에 영향을 줄 수 있으며, 잠재적으로 유전자 발현을 변화시킬 수 있다. 일반적으로 백스플라이싱은 스플라이싱보다 낮은 확률로 일어나지만, mRNA 전구체의 스플라이싱 과정과 경쟁함으로써 원형화가 가능한 엑손을 포함하는 선형 mRNA의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 다시 말해서 엑손의 원형화가 많이 일어날수록 이를 포함하는 mRNA는 적게 나타날 것이다.

5. 결론

 현재까지 RNA-seq 데이터와 새롭게 개발된 생물정보학 접근법을 통해 다양한 생명체에서 수만 개가 넘는 종류의 circRNA를 발견할 수 있었다. CircRNA에 대한 추가적인 연구는 빠른 속도로 이루어지고 있지만, circRNA의 생성과 기능에 관한 많은 질문들에 대해서는 아직 답이 나오지 않고 있다. 특히 스플라이세오솜이 어떻게 백스플라이싱 과정에 관여하며, 일반적인 스플라이싱과 백스플라이싱을 선택적으로 수행하는지는 정확히 밝혀지지 않았다. 광범위하게 존재하는 선택적 스플라이싱과 백스플라이싱은 유사한 메커니즘에 의해 조절될 수 있다. 다양한 생물학적 환경에서 circRNA의 생성에 관여하는 추가적인 cis 및 trans 조절인자와 환경에 따른 circRNA의 상이한 발현 패턴도 앞으로 연구되어야 하는 과제이다. 또 다른 흥미로운 질문은 어떻게 세포질과 핵 사이의 circRNA의 수송이 조절되는가 하는 것이다. 검증되지 않은 가설 중 하나는 circRNA의 수송이 mRNA 수송을 조절하는 것과 유사한 메커니즘에 의해 영향을 받는다는 것이다. 그리고 circRNA의 안정적인 원형 구조 때문에 어떻게 분해(degradation) 되는지도 큰 관심사다.

어느 정도까지 circRNA의 발현과 기능이 보존되어 있는가 하는 질문 또한 보다 철저한 연구가 필요하다. 중요한 것은 세포 내에서 circRNA가 무슨 일을 하는지 아는 게 거의 없다는 점이다. miRNA와의 상호작용 및 전사 과정의 조절에 더하여 circRNA는 그리고 거대한 생체분자 복합체의 결합 부위를 제공하는 역할도 수행할 것이다. 일부 circRNA는 RBP의 스폰지 역할을 수행함으로써 유전자 발현을 조절할 수 있는 반면, 다른 circRNA는 비정상적인 안정성과 구조로 인해 예측되지 않은 세포 내 기능을 가진다. 인간의 질병에 따라 달라지는 circRNA의 발현량 결과는 circRNA가 중요한 생리학적 역할을 할 수 있음을 보여 준다. CircRNA가 인간의 침과 혈액에서도 발견되기에 이를 질병 바이오 마커로 사용하고자 하는 연구도 이루어지고 있다.

분자 수준에서 circRNA 생성에 대한 심층적인 이해는 circRNA의 기능을 이해하는 데 매우 중요하다. CircRNA는 관련된 선형 전사체로와 함께 발현되면서 동시에 독특한 구조적 특징을 지니고 있기 때문에, 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 이러한 RNA 원형 고리를 연구하는 방법이 개발되기를 기대하고 있다. 결론적으로 circRNA가 진핵생물 전사체의 다양성과 복잡성을 증가시키고 있다는 것은 분명해 지고 있다.

...................(계속)

출처:생물학연구정보센터(BRIC)  (바로가기)